流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）、免疫熒光成像、微球陣列技術(shù)、體外診斷等多種領(lǐng)域中，熒光染料是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞標(biāo)記和信號檢測的核心工具。其中PE（藻紅蛋白）、APC（別藻藍(lán)蛋白）、及 PerCP（多甲藻黃素-葉綠素蛋白復(fù)合物）?是常用的熒光染料，主要用于偶聯(lián)抗體，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞表面或胞內(nèi)分子的特異性檢測或定位。

一、R-藻紅蛋白（R-Phycoerythrin, R-PE）

R-PE 是流式細(xì)胞術(shù)中最經(jīng)典、應(yīng)用最廣泛的熒光染料之一，屬于藻膽蛋白（Phycobiliprotein） 家族，其主要的天然來源是紅藻。R-PE具有極高的熒光亮度和光穩(wěn)定性。

1. 天然PE

• 來源與結(jié)構(gòu)：天然提取主要來自海洋紅藻（如 Porphyridium cruentum），核心結(jié)構(gòu)是由 α、β、γ 三個(gè)亞基組成的球狀蛋白，每個(gè)亞基結(jié)合多個(gè)藻紅素（Bilin）發(fā)色團(tuán)（主要是藻紅膽素 PEB 和藻尿膽素 PUB），這些發(fā)色團(tuán)是其強(qiáng)熒光的核心來源。
• 光譜特性：
  • 激發(fā)波長（Excitation）：主要激發(fā)光為 488 nm和 561 nm，適配流式細(xì)胞術(shù)最常見的激發(fā)光源；
  • 發(fā)射波長（Emission）：最大發(fā)射峰約 576?nm（橙黃色熒光），信號可被流式細(xì)胞儀的 575/26?nm 等濾光片捕獲。

2. PE活化

天然 PE缺乏能與抗體發(fā)生穩(wěn)定共價(jià)結(jié)合的活性基團(tuán)（如氨基、羧基、巰基等），無法直接與抗體偶聯(lián)，需通過化學(xué)修飾引入活性基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定偶聯(lián)。具體過程可分為兩步：?

第一步：PE 活化（引入活性位點(diǎn)）利用化學(xué)試劑（如 NHS 酯、馬來酰亞胺）對 PE 進(jìn)行修飾：?

? 若用NHS 酯修飾，會(huì)在 PE 的賴氨酸殘基上引入 “NHS 活性酯基團(tuán)”，該基團(tuán)可與抗體賴氨酸的氨基（-NH2）發(fā)生酰胺化反應(yīng)，形成穩(wěn)定的酰胺鍵；? ?

? 若用馬來酰亞胺修飾，會(huì)在 PE 上引入 “馬來酰亞胺基團(tuán)”，該基團(tuán)可與抗體還原后暴露的巰基（-SH）發(fā)生硫醚化反應(yīng)，偶聯(lián)位點(diǎn)更特異（避免影響抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)）。?

第二步：活化 PE 與抗體偶聯(lián)活化后的 PE（如 NHS-PE、Maleimide-PE）可與抗體在特定條件（如 pH 7.2-7.4、室溫孵育 1-2 小時(shí)）下反應(yīng)，通過共價(jià)鍵形成 “PE - 抗體偶聯(lián)物”，且偶聯(lián)后 PE 的熒光亮度和光譜特性不受影響。

3. 性能優(yōu)勢
   • 熒光亮度極高：比傳統(tǒng)小分子染料（如 FITC）亮 20-30 倍，適合檢測低表達(dá)抗原（如某些細(xì)胞因子受體、少量表達(dá)的表面分子）；
   • 光穩(wěn)定性強(qiáng)：不易發(fā)生光漂白，可長時(shí)間檢測或用于高功率激光下的實(shí)驗(yàn)；
   • 水溶性好：與抗體偶聯(lián)后不易聚集，保證標(biāo)記效率和檢測重復(fù)性。
4. 主要應(yīng)用

PE 是流式實(shí)驗(yàn)中的 “通用型染料”，幾乎覆蓋所有需要高亮度標(biāo)記的場景：

• • 基礎(chǔ)細(xì)胞表型分析：最常用于標(biāo)記免疫細(xì)胞表面分子，如 T 細(xì)胞（CD3-PE）、B 細(xì)胞（CD19-PE）、NK 細(xì)胞（CD56-PE）等，尤其適合低表達(dá)抗原（如 CD25、CD127）的檢測；
  • 多色流式實(shí)驗(yàn)：因激發(fā)波長兼容 488 nm、發(fā)射不與 FITC（525 nm）/PerCP（675 nm）重疊，常作為多色 panel（如 4-6 色）中的 “中亮度通道”，與 FITC（低亮度）、APC（高亮度）搭配使用；
  • 功能細(xì)胞檢測：如細(xì)胞凋亡（Annexin V-PE）、細(xì)胞增殖（CFSE 與 PE 通道區(qū)分）、細(xì)胞因子（IFN-γ-PE）等；
  • 臨床診斷：用于白血病 / 淋巴瘤免疫分型、免疫功能評估（如 T 細(xì)胞亞群 CD4-PE/CD8-PE）。

二、藻藍(lán)蛋白（Allophycocyanin, APC）

APC 與 PE 同屬藻膽蛋白，是流式細(xì)胞術(shù)中亮度最高的染料之一，因發(fā)射紅光、光譜干擾少，成為多色流式的 “核心高亮度通道”。

1. 天然APC

• 來源與結(jié)構(gòu)：提取自藍(lán)藻（如 Spirulina platensis），結(jié)構(gòu)為 α、β 亞基組成的二聚體，每個(gè)亞基結(jié)合 藻藍(lán)膽素（PCB）發(fā)色團(tuán)，發(fā)色團(tuán)數(shù)量多于 PE，因此熒光亮度更高；
• 光譜特性：
  • 激發(fā)波長：主要激發(fā)光為 633 nm或 594?nm；
  • 發(fā)射波長：最大發(fā)射峰約 660 nm（紅光），信號可被 660/20 nm 濾光片捕獲。

2. 交聯(lián) APC（Cross-linked APC, clAPC）

clAPC 是 APC 的化學(xué)修飾形式，通過 “交聯(lián)劑” 將 APC 分子連接成多聚體（如二聚體、三聚體），核心目的是進(jìn)一步提升熒光亮度，用于檢測 “極低表達(dá)” 或 “極稀有靶點(diǎn)”。

• 修飾原理：利用交聯(lián)劑（如戊二醛、BS3）將多個(gè) APC 單體的氨基（賴氨酸殘基）交聯(lián)，形成 APC 多聚體（clAPC）；
• 特性變化：
  • 熒光亮度：比單體 APC 亮 2-3 倍（因多聚體含更多 PCB 發(fā)色團(tuán)，可吸收更多激發(fā)光并發(fā)射更強(qiáng)熒光）；
  • 光譜特性：激發(fā)（633 nm）和發(fā)射（660 nm）波長與單體 APC 基本一致，僅熒光強(qiáng)度提升；
  • 穩(wěn)定性：交聯(lián)后分子結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，抗蛋白酶降解能力增強(qiáng)，但水溶性略有下降（需優(yōu)化偶聯(lián)工藝避免聚集）。

3. APC活化

無論是天然 APC 單體，還是經(jīng)交聯(lián)形成的 clAPC 多聚體，其分子結(jié)構(gòu)均缺乏能與抗體穩(wěn)定結(jié)合的高活性基團(tuán)，需通過化學(xué)修飾引入活性位點(diǎn)，才能實(shí)現(xiàn)與抗體的共價(jià)連接。

活化的本質(zhì)是通過化學(xué)修飾，為兩種染料引入能與抗體反應(yīng)的活性基團(tuán)，具體作用機(jī)制完全一致：?

?? 引入活性位點(diǎn)：無論是天然 APC 還是 clAPC，均需通過 NHS 酯（如 Sulfo-NHS）或馬來酰亞胺（如 Sulfo-SMCC）修飾，分別引入能與抗體氨基結(jié)合的 NHS 活性酯基團(tuán)，或與抗體巰基結(jié)合的馬來酰亞胺基團(tuán)；? ?

? 保證連接穩(wěn)定性：活性基團(tuán)與抗體反應(yīng)形成的共價(jià)鍵（酰胺鍵、硫醚鍵），可避免實(shí)驗(yàn)中染料從抗體上脫落，確保流式檢測時(shí)熒光信號穩(wěn)定（天然 APC 活化后形成 “APC - 抗體” 偶聯(lián)物，clAPC 活化后形成 “clAPC - 抗體” 偶聯(lián)物，二者均依賴共價(jià)鍵實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定連接）。

4. 性能優(yōu)勢
   • 熒光亮度極高：比 PE 亮 1.5-2 倍，是檢測極低表達(dá)抗原（如干細(xì)胞表面標(biāo)志物、稀有細(xì)胞亞群分子）的首選；
   • 光譜干擾少：發(fā)射波長在紅光區(qū)，與 FITC（525 nm）、PE（575 nm）、PerCP（675 nm）的重疊度極低，適合多色流式（如 6-10 色）；
   • 穩(wěn)定性好：雖略遜于 PE，但仍遠(yuǎn)優(yōu)于小分子染料，適合長時(shí)間實(shí)驗(yàn)。
5. ?主要應(yīng)用

APC 因高亮度和低干擾，是多色流式的 “主力染料”：

• • 稀有細(xì)胞檢測：如循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs，標(biāo)記 EpCAM-APC）、造血干細(xì)胞（CD34-APC）、調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg，CD127-APC，因 CD127 在 Treg 上低表達(dá)）；
  • 高復(fù)雜度多色實(shí)驗(yàn)：在 8-12 色流式 panel 中，APC 常作為 “高亮度通道”，與 PE-Cy7（785 nm）、APC-Cy7（785 nm）等遠(yuǎn)紅染料搭配，減少光譜重疊；
  • 功能檢測：如細(xì)胞因子檢測（IL-4-APC、TNF-α-APC）、細(xì)胞凋亡（7-AAD 與 APC 通道區(qū)分，7-AAD 發(fā)射 670 nm，與 APC 輕微重疊，需補(bǔ)償）；
  • 臨床與科研通用：從基礎(chǔ)免疫分型（如 CD45-APC 作為白細(xì)胞通用標(biāo)記）到臨床疾病診斷（如淋巴瘤免疫分型）均廣泛應(yīng)用。

三、多甲藻黃素 - 葉綠素蛋白復(fù)合物（Peridinin-Chlorophyll-Protein Complex, PerCP）

PerCP 是一種從甲藻（如 Amphidinium carterae）中提取的天然色素復(fù)合物，因發(fā)射遠(yuǎn)紅光、光譜獨(dú)特，主要用于多色流式的 “補(bǔ)償通道” 或 “高表達(dá)抗原標(biāo)記”。

1. 基礎(chǔ)背景

• 來源與結(jié)構(gòu)：由多甲藻黃素（Peridinin，一種類胡蘿卜素）、葉綠素 a（Chlorophyll a）和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物，核心是 Peridinin 吸收光后將能量傳遞給葉綠素 a，最終由葉綠素 a 發(fā)射熒光；
• 光譜特性：
  • 激發(fā)波長：主要激發(fā)光為 488 nm，與 FITC、PE 共享激發(fā)光源；
  • 發(fā)射波長：最大發(fā)射峰約 675 nm（遠(yuǎn)紅光），信號可被 670/30?nm 濾光片捕獲。

2. 性能優(yōu)勢與局限：
   • 優(yōu)勢：發(fā)射波長在遠(yuǎn)紅光區(qū)，與 FITC（525 nm）、PE（576?nm）的光譜重疊極少，適合多色搭配；
   • 局限：
     • 熒光亮度低：僅為 PE 的 1/5-1/10，遠(yuǎn)低于 APC，不適合低表達(dá)抗原；
     • 光穩(wěn)定性差：易發(fā)生光漂白，需快速檢測，不適合長時(shí)間實(shí)驗(yàn)；
     • 易聚集：與抗體偶聯(lián)后易形成聚集體，可能導(dǎo)致非特異性染色。

3.?主要應(yīng)用

PerCP 因亮度低、光譜獨(dú)特，應(yīng)用場景相對局限，主要用于高表達(dá)抗原標(biāo)記和多色補(bǔ)償：

• 高表達(dá)抗原的多色標(biāo)記：僅用于標(biāo)記 “極高表達(dá)” 的分子（如白細(xì)胞通用標(biāo)志物 CD45-PerCP、T 細(xì)胞標(biāo)記 CD3-PerCP），因高表達(dá)可彌補(bǔ)亮度不足的問題；
• 多色流式的補(bǔ)償調(diào)節(jié)：在 4-6 色實(shí)驗(yàn)中，PerCP 常作為 “遠(yuǎn)紅通道”，與 FITC（綠）、PE（橙）、APC（紅）搭配，減少各通道間的光譜重疊（如 PerCP 與 APC 發(fā)射波長接近，需輕微補(bǔ)償，但與 PE 無重疊）；
• 替代方案對比：因亮度和穩(wěn)定性不足，PerCP 逐漸被 PerCP-Cy5.5（PerCP 與 Cy5.5 串聯(lián)，亮度提升 3-5 倍，發(fā)射 710 nm）取代，目前僅在傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)或低成本需求中使用。

?

以上三種熒光染料綜合來講：

• 天然染料（PE/APC/PerCP）?是直接用于檢測的 “基礎(chǔ)工具”，亮度和光譜決定其應(yīng)用場景（PE 通用、APC 高亮度、PerCP 遠(yuǎn)紅）；
• 活化修飾（活化 PE / 活化 APC）?是 “原料工具”，用于制備標(biāo)記抗體，服務(wù)于定制化實(shí)驗(yàn)；
• 交聯(lián)修飾（clAPC）?是 “增強(qiáng)工具”，通過多聚化提升亮度，滿足極致檢測需求。

在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，需根據(jù)抗原表達(dá)水平、激發(fā)光源、多色搭配需求選擇合適的染料，例如：低表達(dá)抗原選 APC/clAPC，高表達(dá)抗原選 PerCP，通用場景選 PE。

?

Home Algae Biotech（鴻藻生技股份有限公司）是一家國立海洋大學(xué)技術(shù)支持，坐落于中國臺灣北部臨海的藻類應(yīng)用技術(shù)開發(fā)公司，于2020 年獲科技部「新型態(tài)產(chǎn)學(xué)研鏈結(jié)—價(jià)值創(chuàng)造計(jì)劃」研究經(jīng)費(fèi)補(bǔ)助，擁有自己的藻類種原庫及規(guī)模養(yǎng)殖系統(tǒng)。團(tuán)隊(duì)成員專精于海藻選種、育種與規(guī)模養(yǎng)殖技術(shù)，后端富有蛋白質(zhì)活性成分純化萃取、抗體接合，及保健品開發(fā)等研發(fā)能量，生產(chǎn)流程取得 ISO9001 質(zhì)量管理系統(tǒng)認(rèn)證。

公司主產(chǎn)品「天然熒光標(biāo)記蛋白」為現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究及臨床領(lǐng)域，如細(xì)胞觀測、細(xì)胞分選（例：循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測 (CTC)、細(xì)胞治療）所不可或缺的試劑，其次，公司所生產(chǎn)之藻類萃取原料完成國際化妝品命名協(xié)會(huì) (INCI) 登錄，經(jīng)工研院原料安全及功效測試報(bào)告支持，為美妝保養(yǎng)、保健營養(yǎng)品產(chǎn)業(yè)中越漸熱門的配方選擇。公司現(xiàn)為臺灣抗體協(xié)會(huì)、英國 Pivotal Scientific Limited PSL Alliance 生技聯(lián)盟成員。

?

主要提供：

Purified R-Phycoerythrin (R-PE)??(Cat#HA201)

Activated R-Phycoerythrin (Activated?R-PE)?(Cat#HA202)

Purified Allophycocyanin (APC)?(Cat#HA203)

Crosslinked Allophycocyanin (CL-APC)?(Cat#HA204E)

Peridinin-Chlorophyll-protein (PerCP)?(Cat#HA206)